原标题：20位科学家发文再质疑NgAgo实验结果 | 韩春雨回应：近期已再次重复
作者：陈晓雪 来源：公号“知识分子”
11月15日，20位科学家在学术期刊《蛋白质与细胞》（Protein &； Cell）以来信（Letter）形式在线发表文章“关于NgAgo的疑问（Questions about NgAgo）”备受关注的NgAgo可重复性争议日前有了新进展。
11月15日，学术期刊《蛋白质与细胞》（Protein & Cell）以来信（Letter）形式在线发表了一篇题为“关于NgAgo的疑问（Questions about NgAgo）”的文章，由国内外20家实验室的负责人联合署名，对河北科技大学副教授韩春雨等人发表在《自然-生物技术》（Nature Biotechnology）的论文结果提出质疑，表示无法重复韩春雨的NgAgo实验结果。
这20位作者名单中，有17位是国内学者，其中包括10月10晚实名发声“未能重复韩春雨实验”并呼吁第三方介入调查的11位科学家（谷峰、黄志伟、李劲松、王皓毅、李伟、孙育杰、魏文胜、吴强、王晓群、熊敬维、杨辉），另有三位科学家在国外机构任职，包括美国国立卫生研究院人类基因组研究所资深研究员Shawn Burgess、美国约翰霍普金斯大学医学院教授程临钊以及美国加州大学洛杉矶分校教授林硕。
《蛋白质与细胞》（Protein & Cell）由高等教育出版社、北京生命科学院和中国生物物理学会2010年联合创办，清华大学教授、中科院院士饶子和担任主编。
20位科学家称实验无法重复，已排除细胞污染
20位科学家针对韩春雨NgAgo论文图4结果的重复实验显示，未能在靶向位点检测到Indels。来源：Burgess, S., Cheng, L., Gu, F. et al. Protein Cell (2016).
《自然-生物技术》刊发韩春雨NgAgo实验结果显示，DNA介导的基因编辑工具NgAgo可以在哺乳动物基因组的47个位点实现100%的基因编辑，效率为21.3%-41.3%。来源：Gao, Feng, et al. Nature Biotechnology (2016).今年5月12日，韩春雨团队在《自然-生物技术》发表的文章显示，DNA介导的基因编辑工具NgAgo可以在哺乳动物基因组的47个位点实现100%的基因编辑，效率为21.3%-41.3%。
在《蛋白质与细胞》发表的这篇来函文章中，署名的20位作者指出，他们在不同的细胞系以及小鼠、斑马鱼等系统中对NgAgo的基因编辑活性进行了测试，但没有一个实验发现NgAgo能够实现韩春雨论文中所称的基因组DNA的编辑。之后，一些作者转而使用韩春雨使用的或提供的质粒进行重复实验，“再一次，内源基因组DNA的编辑没有成功”。
作者们对韩春雨论文中的图4结果也进行了独立重复实验，在293T细胞中选择了韩春雨论文报告的相同基因进行测试。“几个不同实验室的研究者独立完成了他们的实验，但在靶向位点没有观察到任何Indels。”文章写道。Indel是分子生物学中的一个术语，是“insertion”（插入）和“deletion”（缺失）两个单词的缩写，指的是在DNA中的核苷酸插入或缺失。因为NgAgo实现编辑基因的结果为插入或缺失Indel，无法观察到Indel就被认为不符合预期结果。
文章的补充材料中还包括署名作者们在不同系统中尝试NgAgo的结果，“这些研究没有一个证明NgAgo有基因组编辑的活性”。
此前，韩春雨曾多次在接受媒体采访时称，重复不出来的实验室可能存在“细胞污染”等问题。作者们表示，不可能所有的独立实验室都出现细胞污染，“事实上，多位署名作者的实验室在做重复实验之前，都会首先检测细胞，确保它们不受支原体的污染。”
韩春雨原始论文中图3C的结果示意图，上图显示了为NgAgo设计的的ssDNA以及为Cas9设计的sgRNA在它们的目标质粒pEGFP-N1上的位置。下图显示了在western杂交实验中HELA细胞中目标质粒pEGFP-N1的产物eGFP的表达水平，还标注了这些实验中针对该质粒的NgAgo和对应的ssDNA或者Cas9和对应的sgRNA。最下方的图显示了eGFP和内参基因actin条带的灰度比值。来源：Gao, Feng, et al ，Nature biotechnology (2016)文章还指出，他们在重复韩春雨论文中图3c的结果时，确实在转染NgAgo和靶向GFP（绿色荧光蛋白）后看到GFP表达下降，但是并无法通过测序证实这是DNA突变的结果。“很多因素都可以影响到GFP的表达，比如NgAgo靶向DNA的能力，以及转染造成的非特异性应激（non-specific stress）等。”作者们在文章中解释说。
此外，韩春雨曾在多次报告中称NgAgo实验需要“高超的实验技巧”，但20位作者的质疑文章反驳了这一说法——“无论是论文最初刊发的实验流程还是在Addgene网站发布的最新信息，这些步骤似乎都不需要‘高超的实验技巧’。”部分作者甚至派学生到韩春雨的实验室拜访学习，但在此期间，他们都未获允许操作哺乳动物基因组编辑的实验。其结果就是，没有一个学生得到证实韩春雨数据的信息。
在文章最后，作者们表示，希望原始论文的作者们能够澄清有关NgAgo的疑点，提供所有的实验细节以重复其最初的结果。
据文章的通讯作者之一、北京大学生命科学学院研究员魏文胜介绍，他们曾在10月中旬将这篇文章投给最初发表NgAgo论文的《自然-生物技术》，但《自然-生物技术》在此之前已收到一篇类似的文章，20位科学家遂转投《蛋白质与细胞》，文章得以快速评审并发表。
韩春雨最新回应：再次重复成功
此前，韩春雨曾向《知识分子》表示，科学的问题要通过科学的方法去解决，“第二篇文章（关于NgAgo的文章）出来之前，这种质疑声音始终都会在的，不可能通过几次报道，就解决问题的。” 学术期刊《细胞研究》（Cell Research）常务副主编李党生博士也曾向《知识分子》表示，科学上的争议的最终解决只能靠科学共同体的进一步验证。
面对《蛋白质与细胞》在线发表的针对NgAgo可重复争议的文章，韩春雨在11月16日下午回应《知识分子》称，（质疑）文章的具体内容他还没有看，但他的实验室已经再次重复实验并成功，只是“细胞需要处理才能做”。然而，韩春雨拒绝透露处理细胞的详情，称“这个处理还没有完善，如果要发文章，做出回应（correspondence），还需要把这个东西进一步明确”。
韩春雨说，他还找了两家实验室，按照他确定的方法能做出来。但是他不愿意透露这两个实验室的名字。
悬疑：“谁来调查这件事情？”
在学术期刊上发表针对已有研究工作的质疑是解决学术争议的重要一步，但是有关韩春雨实验是否可以重复，当前出现了尖锐对立的两种观点一直无法得到澄清。“如果不能重复，这究竟是一种诚实的错误，还是一种学术不端行为，现在依然不清楚”，中科院科技政策研究所研究员李真真对《知识分子》表示，“谁来调查这件事情？这么巨大争议的问题现在没人管，说明我们国家的科学共同体应对此类问题还很不成熟。”
20位署名作者名单
Shawn Burgess，美国国立卫生研究院人类基因组研究所资深研究员；
程临钊，约翰霍普金斯大学医学院教授；
谷峰，温州医科大学眼视光学院研究员；
黄军就，中山大学生命科学学院教授；
黄志伟，哈尔滨工业大学生命科学与技术学院教授；
林硕，加州大学洛杉矶分校分子、细胞与发育生物学系教授；
李劲松，中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员；
李伟，中科院北京动物所研究员；
秦伟，北京大学深圳研究院教授；
孙育杰，北京大学生物动态光学成像中心研究员；
松阳洲，中山大学生命科学学院教授；
魏文胜，北京大学生命科学学院、生物动态光学成像中心研究员；
吴强，上海交通大学系统生物医学研究院教授；
王皓毅，中科院北京动物研究所研究员；
王晓群，中科院生物物理研究所研究员；
熊敬维，北京大学分子医学研究所研究员；
席建忠，北京大学工学院研究员；
杨辉，中科院上海神经生物学研究所研究员；
周斌，中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员；
张博，北京大学生命科学学院教授。
致谢：王承志对本文亦有贡献。
知识分子，为更好的智趣生活责任编辑：魏巍
