本文从肿瘤的诊疗历史谈起，对肿瘤NGS检测包括NGS测序的历史进行梳理，让大家能够从耳熟能详或鲜为人熟知的历史事件中了解这个行业发展的脉络。温故而知新，希望这些在肿瘤诊疗发展历程中作出过重大贡献的人物和事件，不会随风而逝，反而能激励后人持续创新、续创辉煌。所涉及到的内容皆来源于平日积累和参考资料，有错漏之处欢迎斧正。
目录
1.让人谈之色变的“螃蟹”
2.肿瘤诊疗的发展里程碑
3.基因测序技术的发展历史
4.基于NGS的肿瘤基因检测
5.技术创新驱动肿瘤精准诊疗
让人谈之色变的“螃蟹”
公元前400多年，古希腊的“医学之父”希波克拉底(前460年—前370年)观察到人体内有一种肿胀物能够在体内快速生长，在扩散过程中该肿胀物会伸出许多像手指一样的触角，形似螃蟹，故用螃蟹的拉丁语“carcinos”及“carcinoma”来命名这种疾病。约在300多年后，古罗马学者塞尔苏斯(前28年-前50)将众多古希腊医学经典翻译为拉丁语，在翻译carcinos一词时由于其原指螃蟹，故将其译为Cancer(同样意为螃蟹)，但由于后世肥美的螃蟹经常会走上人们的餐桌，为避免混淆，螃蟹逐渐被crab一词所取代。由此，Cancer成为千百年来医生为之顿足、百姓谈之色变的名词。
肿瘤诊疗的发展里程碑
虽然很早就定义了癌症这种疾病，但直到文艺复兴之后，人们对于癌症的认识才逐渐深入。著名的苏格兰外科医生约翰·亨特(John Hunter，1728-1793)曾提出，一些癌症可以通过手术治愈，并描述了外科医生如何决定手术治疗哪些癌症。威廉·哈尔斯特德(William Halsted)在1882年进行了第一次根治性乳房切除术来治疗乳腺癌。直到20世纪下半叶，这种外科手术仍然是乳腺癌的标准手术。
人类与癌症的斗争从未停止，随着时间的推移，逐步发展出手术治疗、激素治疗、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种手段。化疗药物对肿瘤细胞的选择性低，不能分辨肿瘤细胞和正常细胞，对两种细胞均会“格杀勿论，狂轰滥炸”，在杀灭癌细胞的同时也损伤了部分正常细胞，出现“杀敌一千，自损八百”的尴尬局面，且有较大的毒副作用。靶向治疗就是在治疗癌症的时候，像射箭一样，只针对患病的部分用药，而不伤及健康的部分。而实现靶向治疗的关键是如何找到靶子，也就是需要通过基因检测来找到靶标位置。免疫治疗主要是激活人自身的免疫系统，让免疫细胞去杀灭癌细胞和肿瘤组织。它直接作用的不是肿瘤细胞或组织，而是激活人体自身的免疫系统，最终杀死肿瘤细胞。免疫治疗也不是针对所有患者都适用，同样依赖于基因检测进行个体化治疗。
靶向治疗到底有何神奇之处呢?我们通过两个例子来感受一下。
患者1
73岁 女性
先前诊断为早期乳腺癌，经过乳房肿瘤切除术、放疗及辅助他莫昔芬治疗后顺利出院。然而天有不测风云，3年后病人出现了憋气症状，到医院检查发现肿瘤已广泛侵及颈部、肺部和胸膜，经诊断为乳腺癌晚期。考虑到患者的年龄和癌症转移情况，常规的手术治疗和放化疗都不适合。患者和家属本来已经不抱太大希望，只希望后续治疗能减轻点痛苦。但由于患者持续性呼吸困难，主治医生将患者肿瘤组织进行了基因检测，发现了肿瘤细胞具有BRAF V600E突变。在医生的建议下，患者接受了靶向药物维罗非尼(Vermurafenib)治疗。仅过了大约1个月左右，患者呼吸困难症状明显改变;2个月后，进一步的PET成像显示之前颈部和胸部的转移灶明显缩小;6个月后，患者对维罗非尼的耐受良好，PET显像进一步表明疾病明显减轻;23个月后患者仍服用该药治疗，疾病状况控制良好，几乎不伴有与其肿瘤相关的症状了。
患者2
转移性肺癌患者
前期通过基因检测明确是NTRK基因融合，很幸运可以参加拉罗替尼治疗的临床试验。2015年3月，刚刚加入这场试验的时候，患者只能依靠轮椅来移动，凭借吸氧机呼吸，因为转移病灶占据了她90%的肺。很快，“奇迹”开始上演。开始服药的三天内，患者能够坐起来，并且用完整的句子讲话。服药一个月，患者摘掉了呼吸机。服药六个月后，患者甚至可以骑马了。通过三年的随访，影像学检查显示均没有癌症的迹象。
这两位患者都是前期进行了基因检测，发现了具有靶向药物治疗的靶点突变，随后进行靶向治疗，达到了非常好的疗效。
吉非替尼
（gefitinib，商品名易瑞沙）
最早出现的靶向治疗药物，它的上市过程颇有一番曲折。1998年，一期临床试验发现部分化疗后进展NSCLC患者对易瑞沙反应非常迅速，肿瘤明显缩小。2002年阿斯利康将易瑞沙率先在日本上市，2003年FDA批准在美国上市。然而，在III期的ISEL临床试验中，在1692名患者中，吉非替尼并没有较安慰剂表现出明显的优势。2005年FDA不允许吉非替尼在新患者中使用，基本上宣告了吉非替尼在美国市场的结束。同年阿斯利康也撤回了吉非替尼在欧洲的上市申请。2011年阿斯利康主动宣布在美国市场将吉非替尼撤市。
另一方面，从2004年开始，科研人员发现吉非替尼在某些特定人群中，比如亚洲人群或者非吸烟者人群，有更好的疗效。通过多年的不懈努力，科研人员最终发现吉非替尼的疗效和EGFR的基因突变有关。 并通过多项临床试验奠定了吉非替尼一线治疗在EGFR基因具有敏感突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌中的地位。 2009年，欧盟批准易瑞沙用于EGFR突变的非小细胞肺癌的各线治疗， 2015年，易瑞沙又重新回到了美国市场。通过基因检测，将肿瘤病人在分子水平进行分型，可以筛选出药物治疗有效的病人。基因检测挽救了一个投入巨大的药物，更重要的是，给罹患肿瘤的患者带来了新的希望。
随后，以阿法替尼为代表的二代靶向EGFR突变药物上市，让众多患者受益。然而，几乎所有肿瘤都会对药物产生抗药性，导致癌症继续发展。通过基因检测发现，大约三分之二的耐药患者出现EGFR T790M突变，相对应开发的三代药物如奥希替尼可以靶向EGFR T790M突变的肿瘤细胞，进一步延长癌症患者的生存时间。随着研究的不断深入，新的靶向药物不断地被开发，以解决不断进化的肿瘤。任何一款靶向药物的使用之前都需要进行基因检测，以明确患者是否可以从中获益。
O药&K药
（Nivolumab，欧狄沃&Pembrolizumab，可瑞达）
除了靶向药物，近年来，基于免疫检查点抑制剂的免疫治疗大放异彩，成为人类在攻克肿瘤道路上获得的新武器。肿瘤细胞通过免疫检查点分子实现免疫逃逸，免疫治疗通过对免疫检查点分子的抑制激活自身免疫反应，消灭肿瘤细胞。
FDA于 2011 年批准抗CTLA-4的伊匹木单抗上市，用于晚期黑色素瘤患者的治疗，成为全球首个免疫检查点抑制剂药物。PD-1/PD-L1是明星免疫检查点抑制剂，大名鼎鼎的O药(纳武利尤单抗)和K药(帕博利珠单抗)都是PD-1抑制剂。2014年6月O药在日本获得批准用于治疗黑色素瘤，成为全球第一个被批准的PD-1抑制剂;同年7月和9月，FDA先后批准了O药和K药用于治疗黑色素瘤。
PD-1疗法的声名大噪，美国前总统吉米·卡特也助了一臂之力。2015年，91岁的卡特被诊断出患恶性黑色素瘤，而且已经发生了肝转移、脑转移现象，已经是个不折不扣的晚期患者了。卡特经过4个月的K药治疗，脑部的肿瘤神奇般地消失!如今卡特已达98岁高龄，成为美国历史上最长寿的总统。
目前，国产PD-1/PD-L1抑制剂已经有多款产品上市，进入集采后，整体的价格非常亲民，患者大大获益。O药和K药都是可以不区分癌种用药的，这是一个里程碑似的结果。但是，PD-1/PD-L1抑制剂并不能百发百中，解决所有问题。首先，在某些病种中有效率低于20%。其次，有时候副作用比较大，甚至有三级和四级副作用。此外，由于存在免疫超进展，并不是所有人都适合PD-1/PD-L1药物。免疫治疗之前，同样也离不开基因检测，需要在用药前进行MSI、TMB基因检测、免疫超进展相关检测以及PD-L1的免疫组化检测。
随着人类对肿瘤研究的不断深入，抗肿瘤药物的不断发展，对于肿瘤的治疗进入了精准医疗阶段。肿瘤存在高度异质性，不同患者间在疾病进展、治疗敏感性及预后等方面的差别巨大，对肿瘤的诊断从传统形态学分型转变到分子分型，可实现“同病异治”或“异病同治”。基因检测有助于癌症的精准诊断、预测和预后、治疗指导、复发监控及药物研发，从而使得患者获益最大化。
我国肿瘤基因检测的市场也逐年增加，基因检测的高速发展，离不开检测技术，尤其是NGS技术的不断发展以及成本的不断下降。
基因测序技术的发展历史
2001年
6个国家的科学家花了11年的时间、30亿美元，共同发表首个人类基因组工作草图。
2003年
全世界最早的人类全基因组参考序列公布，宣布完成人类基因组计划。人类基因组测序的完成，极大地推动了基因检测技术的发展。
2005年
454 Life Sciences 推出了第一款二代测序仪，开启了二代测序的先河。454技术是基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，是一种边合成边测序(sequencing by synthesis, SBS)的技术，比传统的Sanger测序快100倍。454 Life Sciences用新一代测序仪对DNA双螺旋结构的发现者James Watson进行了基因组测序。
2006年
· 英国剑桥的Solexa公司推出基于边合成边测序(sequencing by synthesis, SBS)技术的高通量测序仪。
· ABI斥资1.2亿美元收购了遗传分析公司Agencourt Personal Genomics(APG)。
2007年
· Roche(罗氏)以1.55亿美元现金和股票收购了454 Life Science，为Roche在此后几年成为二代测序市场的领头羊奠定基础。
· Roche完成对双螺旋结构的发现者James Watson的基因组测序，花费100万美金。
· Illumina以6亿美元收购Solexa，开启二代测序新纪元。
· ABI推出SOLiD高通量测序仪，SOLiD系统是通量最高的新一代测序平台，每次运行可以产生4 Gb的数据。此外，由于它采用双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，能够区分测序错误和多态性，故原始数据的准确性接近99.95%，高于其他的新一代测序平台。
2008年
· Illumina宣布将人类基因组测序费用降至10万美元。
· ABI宣布，利用SOLiD测序平台，人类基因组的测序成本低于6万美元。
2010年
· Illumina推出HiSeq2000系列测序仪，在测序通量上做了长远的布局。
· 454 Life Sciences的创始人乔纳森·罗森伯格(Jonathan Rothberg)创办了新的科技公司Ion Torrent，并于2010年成功推出了当时世上体积最小、检测成本最低的测序仪PGM。
· Ion Torrent被Life Technologies公司收购。而这家Life Technologies公司，正是由ABI公司与Invitrogen公司合并而成!Life technologies的Ion Torrent表现不俗，在NGS竞争中扳回一局。
2014年
Life Technologies 又被 Thermo Fisher Scientific Corporation(赛默飞世尔) 以136亿美元收购。Thermo Fisher Scientific可以量产临床级别的测序仪，占据了一定的市场份额。
2016年
Roche在Illumina的通量和价格的双重夹击下遭受沉重的打击，黯然宣布关闭454。
2017年
Illumina将人类基因组测序成本降低到了1000美元，率先实现了“一千美元测序一个人类基因组”的设想。
由此，Illumina垄断了超过80%的NGS测序市场，紧随其后的Themo Fisher市场占有率仅为不到10%，Roche仅为5%左右，排名前三的厂商总市场占比超过98%。
近几年国产测序平台华大智造在NGS领域也占得了一席之地。华大和Illumina的竞争更多的是专利的竞争。
2013年华大基因开展了收购Complete Genomics的进程。CG位于美国加州山景城，是顶尖的人类全基因组测序服务商。但是CG长于技术，却短于经营。导致当时CG的资金链一天天抽紧，一旦扛不住宣布破产，即进入破产拍卖程序，华大将失去机会，Illumina将垄断整个市场。CG的老对手Illumina此时向美国加州南区地方法院提起诉讼，控告CG侵犯其专利权，打算借此机将CG拖入破产程序。
华大以暗拍的方式参与了收购竞拍。他们最终给出的价格是每股3.15美元，而Illumina给出的价格是3.1美元，二者仅有5分钱的差距。但是谁也没想到，竞拍数月之后，Illumina不甘心就此出局，带着3.3美元的最新出价又杀了回来。Illumina此时开始在媒体造势，声称将CG卖给中国人等于泄露“可口可乐的秘方”，CG的一些股东借机表示华大开价过低，损害了股东利益，质疑CG管理层和董事会成员确定买家太过草率。华大逐字逐条、有理有据地回应了Illumina对华大的指控，说明为何华大基因的收购最有利于股东、客户以及雇员的利益，并质疑Illumina的收购仅仅是为了扼杀测序仪市场的竞争。
最终，华大没有因为Illumina的报价而动摇，3.15美元的出价分文没涨。2013年3月18日，美国外国投资委员会最终批准了华大基因对CG的并购申请。
华大和Illumina的专利之争，并未就此结束。
2019年5月，硝烟四起的专利战争进一步打响，华大智造美国子公司CG向美国特拉华州地区法院提起诉讼，起诉Illumina侵犯了CG的two-color测序专利。随后，Illumina于2019年7月25日提起反诉，主张CG US、华大智造和美洲智造侵犯其“修饰核苷酸”专利。
经过将近3年的拉锯战，2022年5月6日，特拉华州法院对华大智造诉Illumina专利侵权案，及Illumina对华大智造的反诉讼案作出判决：针对华大智造诉Illumina专利侵权案，法院判决Illumina对华大制造的“双色测序技术(Two-color sequencing technolog)”构成故意侵权，并要求Illumina向华大智造赔偿3.34亿美元，折合人民币超22亿元，创造了中国公司在海外专利获赔最大数额记录。针对Illumina向华大智造提起的反诉，法院判决 Illumina宣称被侵权的三项专利全部无效。华大智造在这场持续了三年的专利权纠纷案中获得了压倒性胜利。判决结果一出，Illumina股价应声下跌14.63%，损失达到67.03457亿美金(42.67美金*1.571亿股)，合人民币446.88亿元。
得益于NGS技术的不断更新和成本的不断降低，肿瘤基因检测的应用场景越来越广泛，检测的基因数目和突变类型越来越丰富，市场上也出现了利用不同技术、针对不同应用场景的各种产品。
基于NGS的肿瘤基因检测
2015年1月，美国总统奥巴马在国情咨文演讲中宣布了美国的精准医学计划，尝试通过收集基因组学和其他分子信息为患者提供个性化医疗。随后，中国科技部于2015年3月召开了国家首次精准医学战略专家会议，并计划在2030年前投入600亿元加速中国精准医疗的行业发展。
截止目前，FDA已批准的伴随诊断产品已达45个，来自16个伴随诊断公司。自从2016年首款NGS伴随诊断产品上市，NGS因其检测通量高、更节约样本、可获得更全面的信息、可分析MSI和TMB等多维度分子靶标、能更准确地指导临床等优点在肿瘤基因检测的应用中发展迅速。5年内已有7个NGS产品获得了FDA批准。其中有3款是大panel产品，分别是FoundationOne CDx，Foundation Liquid和Guardant360;有1款是同源重组修复缺陷产品Myriad myChoice。
国家药监局NMPA相继批准了15款基于NGS的多基因检测试剂盒。值得注意的是，这些获批的产品均检测少数几个基因，属于小panel产品。但肿瘤发生发展机制复杂，随着对肿瘤基因组研究的不断深入，发现的与肿瘤治疗相关的基因、标志物也越来越多。实现肿瘤精准分子分型需要检测的基因、变异类型越来越多，小panel产品很难满足不断发展的肿瘤基因检测的各种场景。能一劳永逸实现对不同肿瘤的多方位检测，这是美国FDA给基因检测企业提出的要求。纵观美国FDA批准的肿瘤NGS检测产品(Foudation Focus CDx BRCA ➝ Oncomine Dx Target Test ➝ Praxis Extended RAS Panel ➝ MSK-IMPACT 468基因 ➝ FoundationOne CDx 324基因)，我们可以发现肿瘤NGS检测的未来发展趋势一定是从单一癌种到多癌种，单基因到多基因，小panel到大panel。截止目前，国内尚未有大Panel产品获批。
从适用范围看，用于非小细胞肺癌治疗的伴随诊断试剂最多。CSCO指南针对非小细胞肺癌患者进行EGFR突变、ALK融合、ROS1、RET融合及MET14外显子跳跃的基因检测进行了I级推荐，针对BRAF V600E突变、KRAS突变、HER2扩增/突变，MET扩增以及NTRK融合的基因检测进行了II级推荐，针对基于NGS技术进行TMB检测进行了III级推荐。相应的伴随药物主要集中在吉非替尼、埃克替尼、奥希替尼、克唑替尼等。
在其它各类肿瘤的各种指南中也有对基因检测的广泛推荐，并指导基因诊断产品服务于临床，为患者谋求更大的获益。
当前，肿瘤基因检测产品主要针对组织样本，可以通过病理学诊断找到肿瘤区域，获得较高浓度的肿瘤DNA，检测难度相对较低。另外，绝大部分产品都通过杂交捕获法进行建库，测序步骤则几乎相同，所以产品的灵敏度和特异性都比较接近，虽然各产品的生信分析方法不尽相同，其底层技术是类似的。
临床上，很多身体虚弱的晚期肿瘤患者，没办法进行手术和穿刺，或患者出现多处转移，组织不是很好取，或取得的组织样本量达不到基因检测的需求。肿瘤基因检测陷入了“巧妇难为无米之炊”的境地。此外，手术后的患者，术后的预后评估、辅助治疗方案的评估、复发监测等临床关心的问题，也需要通过基因检测以获得更多的指导。利用血液等体液样本进行的液体活检，由于无创且可多次取样，能很好地解决上述难题。
2018年，美国Guardant Health公司发布了史上最大规模的ctDNA检测研究结果，Guardant 360平台检测了15191例患者的17628份血浆标本和398位患者的组织标本，结果表明，液体活检和组织检测具有相当高的一致性。2020年，FDA先后批准了Guardant360 CDx和Foundation one CDx两款通过液体活检进行肿瘤伴随诊断的产品。
无论是基于组织的检测，还是液体活检，肿瘤基因检测的重要挑战都是检测的灵敏性和特异性。肿瘤基因检测的操作步骤包括核酸的提取、PCR扩增和测序文库的构建、基因序列读取等。这些过程中都会带来检测误差。检测时如何排除掉误差带来的突变，真正能检测出每个患者不同的突变，同时兼顾检测覆盖的基因范围和检测准确度，这是肿瘤基因检测的一个重要难点。 此外，具有临床指导意义的突变，即可诉性突变，在肿瘤组织中的占比常常较低，而在体液中更低(比如ctDNA中的突变)。为获得准确的可诉性突变信息，常常需要加大测序深度，这无可避免地造成了测序成本的提高。如何高特异性高灵敏度地检测可诉性突变是基于NGS的肿瘤基因检测的关键问题。 利用基于组织开发的肿瘤基因检测panel来检测血液中的ctDNA，虽然在加大测序深度的情况下能一定程度提高测序的最低检测下限，但由于杂交捕获效率和样本投入量的原因，很多低频突变无法被捕获，组织检测产品应用于液体活检仍存在一些问题。液体活检的痛点，依赖于底层技术的突破。
技术创新驱动肿瘤精准诊疗
阅尔基因发明了抑制探针置换扩增技术(Blocker Displacement Amplification，BDA)。BDA在常规PCR的基础上，额外增加了一条blocker探针，从而实现对突变型序列富集。
BDA就像一个放大镜，特异地放大了组织内突变型分子的信号，并大大抑制了野生型序列的扩增，可以更便捷更省力地检测到关键的信号。
QASeq技术(Quantitative Amplicon Sequencing)是阅尔基因的另一项专利技术。QASeq是通过加唯一性分子标签(Unique Molecular Identifier, UMI)的方法，去除PCR和基因测序过程产生的错误;并通过多重PCR设计，对DNA序列进行绝对定量，大大提高拷贝数变异分析的灵敏度。此外，通过将扩增子引物设计在热点突变两端，QASeq也可以检测基因突变。
BDA可以特异富集低频突变，大大降低对野生型的不感兴趣分子的扩增，这样的特征使得其特别适用于液体活检、MRD监测等需要超过灵敏度的应用场景，使液体活检真正走向实用化。阅尔基因研发团队将mBDA技术和QASeq技术整合，推出qBDA技术：首先在DNA分子加UMI标签，其次进行mBDA扩增。利用qBDA技术，阅尔基因对液体活检样本进行检测，其最低检测下限可达十万分之五，满足MRD检测所需的检测灵敏度，同时检测数据量又很少，可应用于中低通量测序平台，使检测成本、硬件成本、时间成本都大大降低，满足院内去中心化检测的需要，更有助于NGS检测常规化的实现。
结语
随着人类对肿瘤的认识越来越深入，肿瘤的诊疗对分子检测的依赖性越来越高，对于其检测的要求也越来越精确，催生了检测技术的不断革新。NGS的发展与肿瘤基因检测的发展紧密相随，正是因为NGS技术的成本不断下降，以及检测技术的不断创新，才有肿瘤基因检测市场的繁荣。未来肿瘤基因检测发展的趋势，必然是要求数据量合适，灵敏度高，特异性强，成本低，适用于中低通量测序平台，这样才能推向各级医院，从而造福更多患者。归根结底，满足这些要求，需要向无数前贤智士学习，不断推进底层技术的创新，并将这些创新迅速应用于临床检测。
参考资料：
1.The History of Cancer | First Cancer Diagnosis
2.Milestones in Cancer Research and Discovery - NCI
3.综述 | 人类肿瘤药物发展史
4.PD-L1前世今生：从诺贝尔奖说起_免疫
5.Meet John: Johns Hopkins Kimmel Cancer Center
6.华大基因想干大事：收购美国测序仪公司CG 打通产业链
7.华大智造赢得对Illumina专利诉讼 获赔3.34亿美元
8.中国肿瘤分子诊断蓝皮书
9.2022版非小细胞肺癌CSCO指南
10.Odegaard JI, Vincent JJ, Mortimer S, Vowles JV, Ulrich BC, Banks KC, et al., Validation of a plasma-based comprehensive cancer genotyping assay utilizing orthogonal tissue- and plasma-based methodologies. Clin. Cancer. Res. 2018, 24: 3539-3549.
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关于阅尔基因
阅尔基因是一家技术创新驱动的全球基因组学公司，拥有多项革命性的分子检测技术，可将所有NGS平台的测序成本降低98%以上，并将qPCR、Sanger和纳米孔测序的灵敏度提高100倍以上。阅尔基因在美国休斯顿、中国上海和中国苏州均设有分部。阅尔基因的愿景是创造负担得起的、及时的和准确的基因分析工具，与诸多合作伙伴一起实现精准医疗并改善患者预后。
